全面靶向多种细胞谱系！周斌团队开发了70+新交叉驱动序列 | Cell Press对话科学家
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2021年2月9日，来自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的周斌团队在细胞出版社旗下期刊Cell Stem Cell上在线发表A Suite of New Dre-recombinase Drivers Markedly Expands the Ability to Perform Intersectional Genetic Targeting的研究，科学家们开发了70多种新的交叉驱动序列，以更全面地靶向多种细胞谱系。他们还使用了这组新驱动子中的部分序列来更有针对性地敲除复杂组织中的基因，这些新的转基因工具扩展了交叉遗传方法，同时提高了其准确性。
Cell Press细胞出版社微信公众号对该论文作者团队进行了采访并对论文进行了解读，旨在与广大科研人员深入分享该研究成果以及一些未来的展望，点击“阅读原文”或识别下图二维码阅读英文原文。
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摘要
使用Cre-loxP和Dre-rox双同源重组酶系统介导的交叉遗传方法显著提高了体内谱系示踪以及基因操作的精度。但是，这种方法受限于现有的Dre重组酶驱动子结构。在此，我们开发了70多种新的交叉驱动序列，以更全面地靶向多种细胞谱系。为了突出其适用性，我们使用这些新工具研究了体内血管周围祖细胞的脂肪形成命运，揭示了PDGFRa+血管周细胞是成人脂肪细胞的内源性祖细胞，而非PDGFRa–PDGFRb+细胞。除了细胞谱系示踪之外，我们还使用了这组新驱动子中的部分序列来更有针对性地敲除复杂组织（例如白色脂肪细胞和淋巴管）中的基因，而在此之前，仅通过常规Cre驱动子不能选择性地靶向这些基因。总之，这些新的转基因工具扩展了交叉遗传方法，同时提高了其准确性。
作者专访
Cell Press细胞出版社特别邀请周斌研究团队进行了专访，请他们为大家进一步详细解读。
CellPress：
请介绍一下研究的背景和初衷。
周斌研究员：
同源重组酶介导的基因靶向技术在揭示体内特定细胞的生物学功能是非常重要，它可以让我们更深入的了解器官发育，组织稳态和再生，疾病的病理生理过程中细胞和分子机制。同时它也是追踪体内的细胞起源和命运调控的重要工具，也在阐明多种生物学过程（如胚胎发生，肿瘤发生和组织再生）的细胞遗传调控中发挥着重要的作用。在过去的几十年中，有多类型的同源重组酶出现，而Cre-loxP系统则在动物模型中的使用是最广泛的。该系统能否精确的进行遗传操作的关键取决于表达Cre基因启动子的是否特异。但目前的研究中使用的一些Cre驱动程序并不是非常特异，会无意中导致实验结果解释或结论不准确，所以在相关的细胞命运和基因功能分析的结论中也存在着诸多矛盾。同样，近期兴起的单细胞RNA测序技术也表明，组织内的细胞群体具有异质性，要去深入了解某新的细胞类型或亚群在体内的功能，就要在体内进行遗传靶向操作，这样人们才能了解细胞在正常生理和病理生理过程中是否发挥关键作用。目前已经鉴定出许多新的标志物来定义这些细胞亚群，但目前的技术挑战是使用单个标志物很难在体内对特定的细胞亚群进行精确的遗传靶向操作。我们的研究工作目的是更精确研究的体内细胞亚群的功能及机制，为更深入的了解器官发育，组织稳态与再生中的细胞及分子机制提供更多的工具和手段。
CellPress：
相比于利用单一的Cre重组酶进行细胞谱系示踪或基因功能研究，Cre和Dre的组合有何优势？
周斌研究员：
我们利用Dre重组酶构建了一系列细胞类型的特异性小鼠品系，该套品系的工具小鼠与Cre-loxP系统正交结合使用时，可用于对体内细胞和分子研究进行更精确的遗传标记和靶向。可以有效的规避在之前的研究中由于单一的遗传工具标记的不特异所导致的实验结果解释不准确，更好地回答了一些具有争议的科学问题。
CellPress：
为了保持内源基因的完整性，本研究采取了哪些策略？其作用机制分别是什么？
周斌研究员：
对于某些重要的等位基因，保持内源基因完整是至关重要。因为有些基因的杂合子状态可能会对细胞功能产生一定的影响。因此，为了保持内源基因的完整性，本研究将编码Dre或DreER的cDNA下游与内部核糖体进入位点（IRES），再将其敲入翻译终止密码子后的3'UTR的上游。也可以与自行切割的多肽2A进行连接 ，再将其替换内源基因的翻译终止密码子。
IRES的存在使得核糖体可以直接结合mRNA的起始翻译，当在两个基因中间插入IRES元件时，上游蛋白依靠5‘帽子结构起始翻译，下游蛋白则可以依靠IRES起始翻译。这样IRES上下游的蛋白可以同时进行表达，并且翻译出来的两个蛋白是完全独立的。2A肽元件会使核糖体跳过2A肽C末端的甘氨酰（G）-脯胺酰（P）肽键的合成，那么则会“断裂”成两个独立的蛋白。也就是说，IRES元件可以实现“同时转录，独立翻译”，2A肽则是“同时转录，同时翻译”。
CellPress：
本研究如何发现PDGFRa+血管周细胞对成年组织中成熟脂肪细胞形成的作用？
周斌研究员：
在过去的十几年中，关于周细胞或成纤维细胞是否是体内间充质干细胞以及哪种细胞占主要贡献一直都存在着激烈的争论。在之前的研究报道中，使用的是基于Pdgfrb-Cre或诱导型Pdgfrb-rtTA的谱系追踪小鼠，认为周细胞是脂肪细胞的血管周祖细胞。而近期的另一项研究报道，使用Tbx18-CreER标记周细胞或平滑肌细胞后，在多种病理情况下该群细胞仍保持其原来的细胞类型，而对其他细胞谱系并无贡献，例如脂肪细胞。随后研究提示表达PDGFRa的成纤维细胞能够形成脂肪细胞。为了示踪PDGFRa及PDGFRb中不同的细胞亚群，我们利用双同源重组酶技术实现了在一个小鼠体内同时示踪三种不同类型的细胞：PDGFRa+, PDGFRb+, PDGFRa+PDGFRb+。通过研究我们发现PDGFRa+或者PDGFRa+PDGFRb+的细胞，而非PDGFRb+细胞，可以在成体组织中贡献成熟的脂肪细胞。
CellPress：
在试验利用新工具敲除复杂组织中的特定基因时，为什么选择了白色脂肪细胞和淋巴管？
周斌研究员：
因为领域中缺乏特异性靶向白色脂肪细胞的遗传工具，现有的脂肪细胞Cre工具小鼠会同时靶向白色和褐色脂肪细胞。现有的淋巴管内皮细胞Cre工具小鼠，比如Prox1-Cre，不仅靶向淋巴管，而且也靶向心肌细胞，神经细胞，肝细胞等。所以我们利用双同源重组酶技术实现了这两种细胞的特异性遗传靶向。
CellPress：
能否简要描述本研究中NOT和AND逻辑的应用？
周斌研究员：
“NOT”相当于数学集合中的补集，即把所有的脂肪细胞假设成一个集合S，褐色脂肪细胞群被假设成S的一个子集A, 而剩下的白色脂肪细胞群就是子集A在S中的补集。在之前的研究中人们可以实现对所有脂肪细胞的标记（集合S）以及褐色脂肪细胞群（子集A）的特异性标记，但无法实现对白色脂肪细胞的特异性标记。我们使用遗传工具小鼠对白色脂肪的特异性标记过程相当于取了子集A在S中的补集。而“AND”相当于数学集合中的交集，即把内皮细胞群设为集合A，PROX1标记的所有细胞（如淋巴管内皮细胞，神经细胞，心肌细胞，肝细胞，晶状体上皮细胞和纤维细胞等）设为集合B，那么我们使用遗传工具小鼠对淋巴管内皮细胞群进行特异性标记相当于取A和B的交集部分。
作者简介
周斌
研究员
2002年7月毕业于浙江大学医学院，获得临床医学学士学位。2006年7月毕业于中国协和医科大学，获得内科学博士学位。2006年至2010年在美国哈佛大学医学院波士顿儿童医院从事博士后研究。2010年9月至今任中国科学院上海生命科学研究院研究员，研究组长。一直从事谱系示踪技术与细胞命运可塑性研究，主要利用细胞谱系的遗传示踪技术着重探索器官发育和组织再生过程细胞的起源和命运，特别是心血管细胞谱系建立及细胞命运可塑性的分子调控机制。代表性研究工作发表在Nature、Science等学术期刊。
相关论文信息
研究成果发表在Cell Press旗下Cell Stem Cell期刊上，点击“阅读全文”或扫描下方二维码查看论文。
▌论文标题：
A Suite of New Dre-recombinase Drivers Markedly Expands the Ability to Perform Intersectional Genetic Targeting
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(21)00007-2
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.01.007
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